實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)怎么做

實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)怎么做

ICH Q2（R1）分析方法驗(yàn)證：

精密度：分析方法的精密度是規(guī)定條件下對均質(zhì)樣品多次取樣進(jìn)行一系列檢驗(yàn)結(jié)果的接近程度（離散程度）。精密度可以從三個(gè)層次考慮：重復(fù)性、中間精密度、重復(fù)性。精密度考察應(yīng)使用均質(zhì)、可信的樣品。如果得不到，可用人為配制的樣品或樣品溶液進(jìn)行研究。分析方法的精密度通常以多次測量結(jié)果的變異性、標(biāo)準(zhǔn)偏差或變異系統(tǒng)來表達(dá)。

重復(fù)性：在同樣的操作條件下，在較短時(shí)間間隔的精密度，也稱組內(nèi)測量精密度。

中間精密度：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件的改變，如不同日、不同實(shí)驗(yàn)分析者、不同儀器等情況精密度。

重現(xiàn)性：不同實(shí)驗(yàn)室之間的精密度。(合作研究，通常用于方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化)

中國藥典2015版9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則:

精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。

含量測定和雜質(zhì)的定量測定應(yīng)考察方法的精密度。

USP 1225 藥典方法驗(yàn)證:

定義—分析方法的精密度是單個(gè)檢測結(jié)果間的一致程度，當(dāng)方法重復(fù)使用于同一樣品的多個(gè)樣品時(shí)。分析方法的精密度通常以一系列測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）來表示。精密度可以是在正常操作條件下，分析方法重現(xiàn)性和重復(fù)性程度的測量。在本文中，重現(xiàn)性指在不同的實(shí)驗(yàn)室使用分析方法，以共同研究的方式。中間精密度（通常也稱為粗放性）表述的是在同一實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)的變化，不同的天數(shù)，不同的分析人員或相同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的不同儀器。重復(fù)性指的是在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，一小段時(shí)間內(nèi)，由同一實(shí)驗(yàn)人員在相同的設(shè)備上進(jìn)行分析。

測量系統(tǒng)分析（MSA）參考手冊第四版：

重復(fù)性（repeatability）是用一個(gè)評價(jià)人使用相同的測量儀器對同一零件上的同一特性進(jìn)行測量所得到的的測量變差，他是設(shè)備本身的固有變差或能力。重復(fù)性是指在制定的測量條件下連續(xù)測量的原因（隨機(jī)誤差）的變差。重復(fù)性的最佳措辭為：當(dāng)測定條件已被確定和定義-以確定的零件、儀器、標(biāo)準(zhǔn)、方法、操作者、環(huán)境和假設(shè)之下，系統(tǒng)內(nèi)部的變差。

再現(xiàn)性（reproducibility）定義為有不同的評價(jià)人，采用相同的測量儀器，對同一儀器的同一特性進(jìn)行測量所得的平均值的變差。再現(xiàn)性是指測量的系統(tǒng)之間或條件之間的平均值變差。

通過以上四個(gè)定義可以看出重復(fù)性的定義沒有差異，都是四同，短時(shí)間內(nèi)同一操作人員，同一儀器，同一均質(zhì)樣品，同一特性。對于本文開頭的案例來來說，隨機(jī)取20片樣品就表示能代表該批樣品。有爭議的是同一均質(zhì)樣品是取20片研細(xì)后，還是需要驗(yàn)證的那一批樣品，研細(xì)過程是否需要在此時(shí)進(jìn)行考察。

筆者認(rèn)為重復(fù)性是組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差，6次20片研磨相當(dāng)于6次處理樣品，6次提取樣品。在進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，對于同一份研磨樣品認(rèn)為其內(nèi)部是均一的，而取6份研磨后不一定為均質(zhì)樣品，有可能為樣品不均勻?qū)е轮貜?fù)性不合格。這個(gè)時(shí)候就無法判斷是樣品問題還是方法問題。同時(shí)也可以從方法驗(yàn)證的定義與目的來理解。

方法驗(yàn)證的定義和目的見下表。

通過上表可以看出分析方法驗(yàn)證就是“必須闡明方法適合于它使用目的的一個(gè)過程”。分析方法的驗(yàn)證只是證明分析方法能夠適用于該樣品的檢測。這就意味著在方法驗(yàn)證過程中，樣品是固定的，均一的，不能因?yàn)闃悠返膯栴}而對方法證明過程造成干擾。在這個(gè)前提下，樣品的考察或樣品的處理考察就不應(yīng)該在方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)進(jìn)行。研磨是否有吸附，研磨后能放多長時(shí)間，研磨后樣品是否吸潮等都應(yīng)該在含量方法學(xué)驗(yàn)證前已有定論。

當(dāng)采用投片法進(jìn)行含量測定時(shí)，重復(fù)性就應(yīng)該是取規(guī)定項(xiàng)下的片數(shù)投入量瓶中，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)下的操作，得到供試品溶液。同法配置6份。在這個(gè)情況下，投多少片，超聲或振搖多長時(shí)間才能完全溶解都是在驗(yàn)證過程前應(yīng)該研究的。

同樣溶出方法學(xué)中的重復(fù)性怎么做？是將6片樣品投入到溶出杯中，加入規(guī)定量的介質(zhì)按照既定方法操作后取樣進(jìn)樣？還是將1份樣品投入到溶出杯中，加入規(guī)定量的介質(zhì)按照既定方法操作后取6份樣后進(jìn)樣？還是采用原料藥加空白輔料配置成溶出液的形式？筆者認(rèn)為溶出方法學(xué)驗(yàn)證包含兩個(gè)方面，溶出度方法和溶出測定方法的驗(yàn)證。溶出度方法的驗(yàn)證是不同溶出儀，不同轉(zhuǎn)速，批間、批內(nèi)精密度驗(yàn)證。涉及需要進(jìn)行重復(fù)性的是樣品分析方法驗(yàn)證。溶出度中需要測定含量的是溶出杯中已經(jīng)被溶解的樣品，已經(jīng)是溶液狀態(tài)，不包括樣品是如何溶解至溶液狀態(tài)。通過上文對重復(fù)性定義的解釋，均一樣品完全可以采用采用原料藥加空白輔料配置成溶出液的狀態(tài)來進(jìn)行。

在USP1092溶出度試驗(yàn)的開發(fā)和驗(yàn)證中同樣有所說明。對于分析方法，重復(fù)性評估是通過和/或加入安慰劑/標(biāo)準(zhǔn)加入溶液重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行的。通過采用質(zhì)量完好的制劑或與制劑相等組成（原料加輔料）的溶解步驟的獨(dú)立單元進(jìn)行溶解步驟重復(fù)性的證明。

含量與有關(guān)物質(zhì)的重復(fù)性數(shù)據(jù)要求和接受標(biāo)準(zhǔn)在中國藥典2015版9101《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中有明確說明：均應(yīng)報(bào)告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。精密度接受范圍見下表。

溶出度方法驗(yàn)證的數(shù)據(jù)要求和接受在USP1092溶出度實(shí)驗(yàn)的開發(fā)和驗(yàn)證中有所提及：通過多次進(jìn)樣或者每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液分光光度計(jì)讀數(shù)或者使用精密度或者線性數(shù)據(jù)來計(jì)算RSD值，通常可接受的標(biāo)準(zhǔn)：RSD<2%。

對于重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)要求和接受標(biāo)準(zhǔn)在usp 1010分析數(shù)據(jù)的解釋和處理、GB/T 27417-2017 合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南、測量系統(tǒng)分析（MSA）參考手冊第四版中有進(jìn)一步的說明，有興趣的可以仔細(xì)閱讀，進(jìn)一步理解精密度中各個(gè)項(xiàng)目下的定義，數(shù)據(jù)要求等。筆者由于對統(tǒng)計(jì)學(xué)的一竅不通就不在此進(jìn)行闡述。

重復(fù)性不好的一些因素可能包括：

從上述討論中可以看出在實(shí)際工作中方法學(xué)驗(yàn)證中重復(fù)性不是簡單的照本宣科，需要正確理解定義，結(jié)合項(xiàng)目本身的特性，才能真正意義上對重復(fù)性進(jìn)行正確的設(shè)計(jì)，才能達(dá)到方法學(xué)驗(yàn)證的目的。

回到文章開始的問題認(rèn)為最后選擇了哪個(gè)方案？

結(jié)束語：本位為筆者學(xué)習(xí)各個(gè)指導(dǎo)原則和ICH等文件的一些心得體會(huì)，相信在這個(gè)問題上每個(gè)人都有自己的理解和不同看法，如對筆者看法有異議或錯(cuò)誤之處，敬請指出。

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